结合倏逝波激发与超临界角荧光检测改进光学切片

倏逝波显微镜通过将荧光激发限制在靠近细胞/基底界面的薄层内，实现亚衍射轴向切片。然而，该光片的确切厚度往往未知。特别是在流行的物镜型全内反射荧光显微镜（TIRFM）配置中，已报道倏逝波强度呈指数衰减的预期存在较大偏差。传播性（即非倏逝）激发光会削弱光学切片效果，降低对比度，并使 TIRFM 图像的定量分析变得不确定。在此，我们结合方位角与极角光束扫描、暗场散射成像和原子力显微镜技术，以识别这种不必要的背景荧光激发的来源。我们将源自显微镜光学系统和物镜本身的杂散光确定为主要背景来源，而由反射界面处及样品中折射率边界处的倏逝波散射引起的贡献较小。除了激发光的倏逝特性外，荧光团发射的光也可能表现出可观测的倏逝效应。只有位于盖玻片附近的荧光团才能将其近场辐射耦合到可在超临界角检测到的传播波中。我们表明，通过高数值孔径物镜选择性地检测这种超临界角荧光（SAF），可有效抑制来自样品深层区域的荧光，从而改进光学切片。本文提出的显微方案融合了 TIRF 激发与 SAF 检测的优势，为在质膜处或附近对荧光团动力学进行定量宽场成像提供了条件。